Микроклональное размножение растений (in vitro). Размножение растений in vitro Саженцы in vitro

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: питательная среда содержит минеральные соли и регуляторы роста, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно тетраметилтиурамсульфид (ТМТД) в количестве 25-100 мг/л или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола, или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5-50 мг/л метиленового синего и 1-10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20-100 мг/л ТМТД или 25-100 мг/л нистатина. 2 табл.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, в частности к способам микроклонального размножения растений и безвирусному семеноводству. Известен способ микроклонального размножения и выращивания растений in vitro путем посадки микрочеренков на питательную среду, содержащую элементы минерального питания по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста. Недостатком указанного способа является частое "зарастание" питательной среды микроорганизмами-контаминантами при нарушении условий стерильности. Размножение микроорганизмов приводит к накоплению токсических веществ и вследствие этого гибели части растений и, следовательно, возрастанию затрат для получения необходимого их количества, и(или) для поддержания более высокого уровня стерильности. Цель изобретения - подавление роста микроорганизмов-контаминантов, упрощение способа и снижение затрат при выращивании растений in vitro. Предлагаемый способ выращивания растений in vitro заключается в следующем. Посадка микрочеренков в стерильных условиях производится на питательную среду, содержащую минеральные соли, сахарозу, агар-агар и регуляторы роста, в состав которой дополнительно вводят 25-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или ТМТД (25-100 мг/л) и фундазол в количестве 1-20 мг/л или ТМТД(25-100 мг/л) и фундазол (1-20 мг/л) в сочетании с метиленовым синим 2,5-50 мг/л и бриллиантовым зеленым - 1- 10 мг/л. Предлагаемый способ отличается от известного способа выращивания in vitro тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят соединения, обладающие биоцидной активностью против наиболее часто встречающихся в практике микроразмножения растений видов микроорганизмов грибной и бактериальной природы: ТМТД или ТМТД в сочетании с фундазолом или ТМТД в сочетании с фундазолом, метиленовым синим и бриллиантовым зеленым. В результате применения данного способа гибель растений вследствие "зарастания" питательной среды микроорганизмами-контаминантами снижается в 2 и более раз. Соответственно снижаются затраты, необходимые для выращивания дополнительного числа растений. При поддержании коллекций сортов и форм in vitro иногда возникает ситуация "зарастания" всех пробирок данного сорта с угрозой его потери. В случае контаминации чувствительными микроорганизмами черенкование инфицированных растений на предложенную среду позволяет сохранить коллекционный образец. Посадка микрочеренков в стерильных или нестерильных условиях производится на стерилизованный прокаливанием перлитовый песок, пропитанный жидкой минеральной питательной средой без органических добавок, в состав которой дополнительно вводят 20-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или 25-100 мг/л нистатина. Применение компонентов с альгицидной активностью - ТМТД или нистатина - устраняет зарастание микроводорослями, выделяющими токсичные для растений соединения, при выращивании в нестерильных условиях или при случайном нарушении стерильности. Это позволяет также последнее микрочеренкование перед высадкой в теплицу проводить в нестерильных условиях, что позволяет упростить способ выращивания за счет более удобных манипуляций с черенками в нестерильных условиях и уменьшить необходимые площади по сравнению с пробирочной культурой. Пример 1. Биоцидные компоненты в указанных табл. 1 и 2 концентрациях были добавлены к питательной среде для микрочеренкования, содержащей минеральные соли по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста, а также 7 г/л агар-агара и 20 г/л сахарозы, перед ее стерилизацией автоклавированием (120 o C, 20 мин). Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями высаживали в пробирки с питательной средой и выращивали 3-4 нед при температуре 20 o C и освещенности 5000 лк. Учитывали число случайных зарастаний грибной и бактериальной инфекцией. Как видно из табл. 1, суммарное зарастание контаминантами грибной природы снижается в два и более раз при введении в состав среды ТМТД и фундазола. При этом зарастание Penicillium sp. подавляется полностью (в контроле 1.3%), а рост бактерий изменяется незначительно (табл. 2). Введение в состав среды метиленового синего и бриллиантового зеленого является эффективным в качестве антибактериального средства (табл. 2). Пример 2. Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями нестерильно высаживали на перлитовый субстрат, стерилизованный прокаливанием 2 ч при 170 o C и помещенный в чашки Петри, пропитанный питательной средой, содержащей раствор Кноппа или минеральные соли по Мурасиге-Скугу с добавлением регуляторов роста, а также биоцидных компонентов: 25 мг/л ТМТД или 25 мг/л нистатина. По мере подсыхания субстрата проводили полив дистиллированной водой (примерно, 1 раз в неделю). Через две недели в контрольном варианте (без добавления ТМТД или нистатина) отмечено зарастание микроводорослями, в вариантах с добавлением ТМТД и нистатина зарастание отсутствует, вес надземной части растения составляет 100-180% от контроля. Через 1 мес после посадки в контрольном варианте отмечено бурное развитие микроводорослей на поверхности перлита, растения угнетены, отдельные растения погибли, в опытных вариантах небольшой рост водорослей в местах полива, развитие растений нормальное.

Формула изобретения

Способ выращивания растений in vitro, включающий микрочеренкование и посадку микрочеренков на питательную среду, содержащую минеральные соли и регуляторы роста, отличающийся тем, что посадку микрочеренков осуществляют на агаризованную питательную среду с сахарозой или на питательную среду с твердым носителем, в качестве которого используют перлит, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно ТМТД в количестве 25 100 мг/л, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5 50,0 мг/л метиленового синего и 1 10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20 100 мг/л ТМТД или 25 100 мг/л нистатина.

Похожие патенты:

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике гепатита В

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности, к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов G класса в биологических жидкостях организма свиньи

Многих интересует возможность размножения растений in vitro в домашних условиях. Насколько это возможно вы узнаете из этой статьи. Она будет написана на доступном языке, для непосвященных людей.

Для хорошего результата нужно учитывать все правила процедуры. Это увеличивает затраты и выгода будет, только если размножать в достаточно больших количествах.

При размножении путем in vitro посадочный материал выходит достаточно качественный.

Растения лучше адаптируются и бистро развиваются. Имеют сильный иммунитет к заболеваниям.

Начинать клонирование нужно с полной стерилизации как среды, растительного материала, инструментов. Помещение моется дезинфицированными средствами. Желательно чтоб стены были обложены кафелем, что облегчает процедуру. Несколько часов обрабатывается комната кварцевой лампой. Приобретается медицинский комплект в виде халата, шапочки и марлевой повязки. Спецодежда обрабатывается горячим утюгом и кварцуется в той же комнате. Все необходимые инструменты разлаживаются в комнате в момент кварцевания. В обязательном порядке заклеиваются все отверстия, включая вентиляционные. Любая бактерия или микроб попавшая на растение загубит всю операцию.

Вам понадобятся инструмент для разрезания, его лезвие должно быть очень острым и тонким. Чистые емкости и льняные тряпочки, завернутые в фольгу, стерилизуются 1-2 часа при высокой температуре не ниже 200 С, в духовке. Таким же образом стерилизуете дистиллированную воду.

Теперь необходимо обработать растительный материал. Промывается под проточной водой с хозяйственным мылом.

Разводится на 100 мл воды 10 гр. хлорки, это будет дезинфицирующий раствор.

Начинаете работать в комнате с включенной кварцевой лампой. Там же и переодеваетесь в спец одежду. Затем обрабатываете руки и рабочее место спиртом.

На стол ставите три банки со стерильной водой и одну с хлор раствором.

Растительный материал окунаете в раствор. Пинцетом вынимаете один фрагмент через 5 минут, второй через 8, третий через 20 минут. Пинцет после каждого применения накаливайте на огне. Опускаете фрагмент растения в банку с водой на 10 минут. Затем в последующие, для удаления остатков хлора.

На тряпку предварительно обработанную ложится растительный материал. Острым, тонким предметом (скальпель) обожженным над огнем отрезается почка. Под почкой оставляется 5 мм, нал 3 мм. Берете пробирку со специальной смесью и помещаете туда почку. Пробирка герметично закрывается фольгой. Такую операцию проделываете с остальными фрагментами. Не забывайте менять тряпочки и обжигать инструменты после каждого применения.

Теперь пробирки хранятся на полке. Соблюдается 16 часовой световой режим, высокая 70 % влажность. Температура достаточно высокая - 24-28оС. Важно не убить стерилизацией растительный материал, но при этом уничтожить вредоносные бактерии и микробы. В случае правильно проведенной процедуры через месяц появятся крошечные росточки.

Процесс in vitro достаточно щепетилен и требует больших затрат физических ресурсов. Малейший недочет и вся операция будет проведена безуспешно.

М.: Индрик, 2014.

Сборник подготовлен к юбилею доктора исторических наук Ирины Геннадиевны Коноваловой, зам. директора, главного научного сотрудника, зав. Отделом специальных исторических дисциплин и зав. Центром исторической географии Института всеобщей истории РАН, крупнейшего в нашей стране востоковеда, автора большого числа исследований и публикаций источников, выдающегося специалиста в области исторической географии, ответственного редактора недавно организованного ею альманаха "Историческая география". В сборник вошли статьи ее коллег и друзей, написанные по следующим направлениям: историческая география, гуманитарная и культурная география, история географии и картографии.

Для историков, географов, филологов.

Под науч. редакцией: В. Белик, Г. Джамирзоев Т. 1. Махачкала: АЛЕФ, 2011.

В сборник Трудов МОО включены избранные материалы XIII Международной орнитологической конференции Северной Евразии, состоявшейся в г. Оренбурге 30 апреля - 6 мая 2010 г. Тематика статей касается истории Мензбировского орнитологического общества и палеоорнитологии, общих проблем орнитологии, фауны и систематики птиц, их экологии и эволюции, а также вопросов охраны редких видов. Среди информационных материалов публикуется Резолюция XIII Орнитологической конференции Северной Евразии

М.: МИЭМ НИУ ВШЭ, 2016.

В материалах конференции студентов, аспирантов и молодых специалистов представлены тезисы докладов по следующим направлениям: математика и компьютерное моделирование; информационно-коммуникационные технологии; автоматизация проектирования, банки данных и знаний, интеллектуальные системы; компьютерные образовательные продукты; информационная безопасность; электроника и приборостроение; производственные технологии, нанотехнологии и новые материалы; информационные технологии в экономике, бизнесе и инновационной деятельности; инновационные технологии в дизайне. Материалы конференции могут быть полезны для преподавателей, студентов, научных сотрудников и специалистов, специализирующихся в области прикладной математики, информационно-коммуникационных технологий и электроники.

Korsakov I. N. , Kuptsov S. M. , Raznometov D. A. et al. Egyptian Computer Science Journal. 2013. Vol. 37. No. 7. P. 51-61.

This prototype development explains the challenges encountered during the ISO/IEEE 11073 standard implementation process. The complexity of the standard and the consequent heavy requirements, which have not encouraged software engineers to adopt the standard. The developing complexity evaluation drives us to propose two possible implementation strategies that cover almost all possible use cases and eases handling the standard by non-expert users. The first one is focused on medical devices (MD) and proposes a low-memory and low-processor usage technique. It is based on message patterns that allow simple functions to generate ISO/IEEE 11073 messages and to process them easily. MD act as X73 agent. Second one is focused on more powerful device X73 manager, which do not have the MDs" memory and processor usage constraints. The protocol between Agent and Manager is point-to-point and we can distribute the functionality between devices.

Developed both implementation X73 Agent and Manager will cut developing time for applications based on ISO/EEE 11073.

Ястребов Г. А. , Красилова А. Н. , Черепанова Е. С. Научные доклады Лаборатории сравнительного анализа развития постсоциалистических обществ. WP17. Высшая школа экономики, 2011. № WP17/2011/02 (ч. 2).

Hyafil A., Fontolan L., Kabdebon C. et al. eLife. 2015. No. 4. P. 1-45.

Many environmental stimuli present a quasi-rhythmic structure at different timescales that the brain needs to decompose and integrate. Cortical oscillations have been proposed as instruments of sensory de-multiplexing, i.e., the parallel processing of different frequency streams in sensory signals. Yet their causal role in such a process has never been demonstrated. Here, we used a neural microcircuit model to address whether coupled theta-gamma oscillations, as observed in human auditory cortex, could underpin the multiscale sensory analysis of speech. We show that, in continuous speech, theta oscillations can flexibly track the syllabic rhythm and temporally organize the phoneme-level response of gamma neurons into a code that enables syllable identification. The tracking of slow speech fluctuations by theta oscillations, and its coupling to gamma-spiking activity both appeared as critical features for accurate speech encoding. These results demonstrate that cortical oscillations can be a key instrument of speech de-multiplexing, parsing, and encoding.

В условиях происходящей биотехнологической революции, появления инновационных методов лечения, роста общей продолжительности жизни, изменения требований общества к результативности мер по охране здоровья неизбежно происходит увеличение потребности в расходах системы общественного здравоохранения. В этой связи крайне важно иметь инструмент оценки социально-экономической эффективности того или иного решения с учетом отдаленных последствий. Целью пилотного исследования было создание методологически обоснованной экономической базы для принятия решения о целесообразности выделения дополнительных ресурсов российской системы здравоохранения на эффективные с макроэкономической точки зрения технологий. В качестве демонстрационного примера использовалась оценка целесообразности внедрения технологий ранней диагностики и лечения двух заболеваний костно-мышечной системы. Результаты исследования продемонстрировали, что внедрение в практическое здравоохранение России модели раннего лечения артрита является экономически эффективной и целесообразной мерой. Вложения, многократно превосходящие фактически сложившиеся расходы на его лечение, могут быть оправданы с макроэкономической точки зрения, принося дополнительные выгоды государству за счет снижения производственных потерь, обусловленных снижением уровня инвалидизации и восстановлением трудового потенциала.

Ястребов Г. А. , Красилова А. Н. , Черепанова Е. С. Научные доклады Лаборатории сравнительного анализа развития постсоциалистических обществ. WP17. Высшая школа экономики, 2011. № WP17/2011/02 (ч. 1).

Предложенный вниманию читателя материал открывает серию публикаций, целью которой является знакомство с результатами проекта «Сравнительный анализ развития человеческого потенциала в постсоциалистических странах Европы», осуществляемого Лабораторией сравнительного анализа развития постсоциалистических обществ НИУ ВШЭ. В работе, в частности, сформулированы основные теоретико-методологические посылки анализа постсоциалистических трансформаций с точки зрения обеспечения жизнеспособности обществ, под которой на операциональном уровне рассматривается степень реализации потребностей населения в безопасности, образовании, здоровье, самореализации, демографическом и социальном воспроизводстве. При этом, учитывая ограниченность существующих оценок на базе таких общепринятых интегральных показателей, как Индекс человеческого развития ООН, авторы разрабатывают собственное определение жизнеспособности на основе классического определения «здоровья», предложенного Всемирной организацией здравоохранения в 1948 г. Значительную часть работы занимает обсуждение собранной из различных источников (ВОЗ, Всемирный банк, ПРООН и т.п.) эмпирической информации о качестве человеческого развития в ряде стран Европы и СНГ.

В спектре внутренней медицины гастроэнтерология является одной из наименее освещенных научными доказательствами областей. Это не означет, однако, что еe практика не может быть усовершенствована последовательным использованием подходов доказательной медицины

Атлас содержит 8 карт, графики и таблицы, иллюстрирующие основные закономерности и ограничения в области утилизации твердых бытовых отходов в Центральном Федеральном округе. Социальная значимость Атласа состоит в выявлении и типологизации основных "ядер" антропогенного загрязнения, представленных полигонами и свалками ТБО.

Создание атласа осуществлялось при финансовой поддержке Русского Географического общества (грант РГО №59-2013/Н7 "Экологические риски в пригородных и межселенных территориях")

В препринте анализируются некоторые элементы и показатели электронного правительства в различных странах за 2009—2010 годы, и их взаимосвязь с коррупцией в государственном секторе. Широко признан тот факт, что коррупция является нежелательным явлением. При этом продолжаются дискуссии о том, какие из факторов, ее определяющих, наиболее значимы. Авторы исследуют возможную причинно-следственную зависимость установленной взаимосвязи между электронным правительством и коррупцией в государственном секторе. При помощи эконометрического анализа крупных страновых выборок, авторы проверили тесноту связи между индикаторами электронного правительства и показателями Индекса развития ИКТ, такими как качество онлайн-услуг и использование ИКТ, с одной стороны, и уровень восприятия коррупции, с другой стороны. Были проанализированы основные научные публикации, международные рейтинги и базы данных международных организаций. По результатам проведенного исследования предлагаются рекомендации по преодолению слабых сторон международных сопоставительных исследований электронного правительства, а также возможные направления дальнейших исследований в выделенной области.

В статье рассматриваются основы построения моделей измерительных приемников, предназначенных для виртуальных исследований в области ЭМС, в формах, отличных от схемной. Анализируются модели на основе цифровой обработки сигналов, формальные математические модели, а также базирующиеся на графическом программировании. Формулируется общий вывод о перспективах использования таких моделей при построении системы автоматизированного проектирования, реализующей процедуру виртуальной сертификации радиоэлектронных средств по эмиссии излучаемых радиопомех.

В работе была предложена схемная модель отдельных узлов фликерметра. Эту модель можно использовать для оценки уровня фликера в электросетях при виртуальных исследованиях кондуктивных помех, которые являются составляющей общей теории виртуальной сертификации. В будущем на основе этой модели могут быть разработаны инженерные методики, нацеленные на решение практических задач в области ЭМС с широким привлечением средств автоматизации и моделирования.

Разделение вклада в публикацию, написанную в соавторстве, является фундаментальной проблемой библиометрии. Её решение создает основу для последующих исследований. Существуют два решения не требующие никакой дополнительной информации: индекс равного разделение соавторства и индекса Шепли. До настоящего времени индекс Шепли не использовался из-за сложности вычисления. В данной работе показана эквивалентность двух индексов для специально построенных кооперативных игр.

Кн. 2: Разработка моделей надёжности для проектных исследований надёжности радиоэлектронной аппаратуры. М.: МИЭМ, 2010.

Излагаются результаты разработки моделей надёжности для проектных исследований надёжности радиоэлектронной аппаратуры, полученные в ходе выполнения II этапа научно-исследовательской работы « Разработка методов и средств для проектных исследований надёжности радиоэлектронной аппаратуры » выполняемой в рамках тематического плана МИЭМ по теме № 100077 : « Разработка моделей надёжности для проектных исследований надёжности радиоэлектронной аппаратуры » .

Приводятся результаты разработки унифицированных топологических моделей надёжности резервированных групп. Описываются формальные модели типовых групп для нагруженного резервирования, для ненагруженного резервирования, для комбинированного контроля работоспособности, для групп с переключателями и групп с восстановлением. Проанализированы способы реализации γ-процентного контроля работоспособности РЭА и СЧ и даны рекомендации по модификации алгоритмов формирования временных диаграмм состояний типовых резервированных групп для различных способов контроля. Предложены методы формирования временных диаграмм состояний для восстанавливаемых резервированных групп для «последовательного» и «параллельного» соединения компонентов. Приводятся результаты экспериментальной проверки разработанных моделей и методов для проектных исследований надёжности РЭА.

Gokhberg L. , Fursov K. , Perani G. Working Party of National Experts on Science and Technology Indicators. DSTI/EAS/STP/NESTI. Organisation for Economic Co-operation and Development, 2012. No. DSTI/EAS/STP/NESTI(2012)9/ANN1.

Документ содержит проект методологических рекомендаций по статистическому измерению технологий. Он включает предложения по формированию операциональных определений технологий, подходы к идентификации классификации новых и возникающих технологий, а также предложения по разработке системы показателей, характеризующих жизненный цикл технологий, и стратегиям сбора данных. Разработанные рекомендации предлагается использовать в качестве методологической основы гармонизированной системы сбора и интерпретации статистических данных о технологиях. В приложении приводятся сведения о доступных определениях технологий и краткие результаты исследования опыта национальных статистических служб в области статистического наблюдения науки и технологий.

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т.д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т.д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстроувеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М. Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологичеки активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов – эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.

Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro. Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.

Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей–использование ее в клеточной селекции.

Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Иногда, например, при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потомстве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры. Поэтому перед исследователями часто встает задача – размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.

Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.

В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков.

Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.

Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с Использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений. Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей:

андрогенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор.

гиногенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;

партеногенез – получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.

Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за четыре года вместо обычных 10–12 лет. Методом культуры пыльников из сортов и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые характеризуются гомогенностью и стабильностью.

Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый – образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения. Второй – образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.

Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации.

Криосохранение растений

Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (температура – 196° С) – новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда, а также в обеспечении селекционеров в любое время генотипом, имеющим искомые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации; уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезвоживания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки разных видов растений, способных к морфогенезу in vitro; зиготические и соматические зародыши и т.д. В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур (около 10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов). Приоритет в этом направлении принадлежит Институту физиологии растений РАН и, в частности, отделу культуры тканей и морфогенеза, возглавляемому проф. Р. Г. Бутенко.

При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток: отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды; разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации.

Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения: обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от 0 до –40° С (в редких случаях до -70° С), а также специальные предосторожности при оттаивании объектов.

Процесс криоконсервации, как правило, начинается с подготовки культуры клеток к замораживанию. Это может быть достигнуто несколькими способами, предусматривающими культивирование клеток на питательных средах, содержащих различные осмотически активные вещества: маннит или сорбит в концентрации 2–6%, аминокислоты и среди них, в первую очередь, пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно, а также у-аминомасляная кислота.

Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5–10%), глицерин (10–20%), а также непроникающие высокомолекулярные–поливинилпиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000.

Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания от 0 до –40° С. Как правило, для всех объектов устанавливается скорость замораживания 0,5–1 °С в минуту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков).

Таким образом, медленное замораживание и использование криопротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при –40° С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает возможность проводить дальнейшее замораживание, а именно погружать ампулы с растительным материалом в жидкий азот.

Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано. Например, в криобанке Института физиологии растений РАН хранятся клетки моркови, которые находятся в жидком азоте около 20 лет, меристемы картофеля – более 10 лет и др.

Оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте является последним этапом технологии криосохранения. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то оттаивание должно быть проведено как можно быстрее. Для этого ампулы помещают в водяную баню с температурой 40°, а иногда и 60° С и выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда.

Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ – окраска витальным красителем (0,1%-ным феносафранином или 0,25%-ным раствором сини Эванса), в результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным критерием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания.

Экспериментально было показано, что клетки после хранения в жидком азоте не теряют способности к делению, регенерации растений, не уменьшается продуктивность синтеза вторичных метаболитов (клетки продуценты) и т.д. Так, Институтом физиологии растений РАН совместно с НПО по картофелеводству разработаны методы криосохранения меристем четырех сортов картофеля и показана возможность из 20% хранящихся меристем регенерировать целые растения, которые при высадке в поле не отличались по всем признакам, включая темпы роста и продуктивность, от обычных пробирочных растений (С. Манжулин и др., 1982). Более подробно о технике криосохранения можно узнать из обзорных работ А. С. Попова.

Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений.

Наша компания на основе технологии клонального микроразмножения растений производит посадочный материал трёх категорий:

• Микрорастения in vitro , сокращенное обозначение “In Vitro ” (рис. 1)
• Микрорастения in vitro неукоренненные - in vitro Н.У.
• Адаптированный посадочный материал с закрытой корневой системой (ЗКС), сокращенное обозначение “Ex Vitro (ЗКС) ”

В этой статье мы с Вами рассмотрим производство микрорастений In Vitro .

Микрорастения in vitro – это посадочный материал нового поколения, обладающий рядом неоспоримых преимуществ по сравнению с растениями, полученными традиционными методами размножения (отводки, черенкование, прививка), а именно:

• Растения свободны от фитопатогенов;
• Обладают повышенными темпами роста и развития, а в некоторых случаях и более ранним началом цветения и плодоношения;
• Высокая выравненность посадочного материала вследствие его генетической однородности;
• Возможность размножения в неограниченных количествах гибридных форм растений, с сохранением всех ценных признаков;
• Отсутствие сезонности при производстве посадочного материала;
• Возможность производства больших объемов посадочного материала в сжатые сроки;
• Относительно низкая стоимость по сравнению с классическими типами посадочного материала.

Выращивание микрорастений в стандартизированных условиях обеспечивает высокую степень однородности посадочного материала между различными партиями, что дает возможность нашим клиентам более точно планировать объемы и сроки посадок.

Герметичная пластиковая тара и питательный субстрат, в котором выращиваются микрорастения, дают возможность транспортировки продукции на дальние расстояние с сохранением жизнеспособности и посадочных качеств микрорастений, что подтверждается широкой географией наших постоянных клиентов. Компактность упаковки и небольшой вес контейнеров значительно уменьшают транспортные расходы.

Особенности данного способа размножения позволяют в сжатые сроки получать омоложенный оздоровленный посадочный материал как старых, но не теряющих свою актуальность, сортов так и селекционных новинок.

Недостатки:

Основной сложностью при работе с микрорастениями является процесс их адаптации к естественным условиям. Проведение адаптации микрорастений требует определенных навыков и наличия теплиц для первичного доращивания растений in vitro. Адаптация производится в условиях повышенной влажности и с применением других специальных мер по уходу (см. рекомендации по уходу). Требуемые условия необходимо соблюдать в первые 3-5 недель (в зависимости от вида растений) после высадки микрорастений в субстрат. Допустимый выпад (гибель) микрорастений при соблюдении оптимальных условий адаптации составляет 5 – 10% в зависимости от культуры и сорта.

Ключевым потребителем продукции категории "микрорастения in vitro " являются тепличные хозяйства, располагающие зимними отапливаемыми теплицами (агрофирмы, тепличные комбинаты, питомники, фермерские хозяйства и т.д.).

Также мы производим микрорастения флоксов in vitro неукоренненные - in vitro Н.У.

Совмещение стадий укоренения и адаптации микропобегов флоксов открывает возможность увеличения эффективности производства для этой культуры и позволяет значительно сократить сроки получения готовых растений.

• Наличие меристематических очагов, дающих начало корневым зачаткам, позволяет растению развить полноценную корневую систему
• Высадка в теплицу, уход и доращивание не требуют дополнительных усилий
• Микрорастения имеют высокую приживаемость
• По морфологическим показателям микрорастения не отличаются от укорененных in vitro